Tiếng Việt English

Các lưu ý về thao tác khi tiến hành phản ứng ELISA

1. Pipet

  • Pipet phải được hiệu chuẩn thường xuyên theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
  • Tránh chạm đầu tip vào thành giếng.
  • Tránh văng vào mẫu và thuốc thử.
  • Sử dụng một đầu tip mới khi thêm mẫu/ đối chứng/ thuốc thử.
  • Các đầu tip phải đủ độ dài để cung cấp khoảng không khí giữa đầu tip và pipet.
  • Đảm bảo đầu tip pipet được gắn chặt vào pipet để tránh làm rơi đầu tip.

 

2. Microplate

Đĩa 96 giếng dùng trong ELISA (Nguồn ảnh: http://www.phenixresearch.com/)

  • Đưa đĩa ELISA về nhiệt độ phòng trước khi mở.
  • Lượng chất lỏng trong giếng nên đồng đều trong cả đĩa, vì một giếng tách ra độc lập sẽ gây khó khăn cho việc đổ bỏ đĩa và dẫn đến rửa kém hơn.
  • Đặt đĩa trong bóng tối ngay lập tức sau khi thêm cơ chất, vì cơ chất rất nhạy cảm với ánh sáng.
  • Giữ chặt đĩa khi xả để tránh đĩa trượt khỏi bệ giữ (holder).
  • Xoay đĩa 180 và gắn lại vào bệ giữ (holder) hoặc cần sử dụng đúng bệ giữ nếu không phù hợp với đĩa.
  • Đóng kín các giếng chưa dùng đến với các chất làm khô.
  • Ghi lại ngày lần đầu tiên mở túi chứa đĩa.
  • Rửa mặt đáy của đĩa với dung dịch đệm rửa để loại bỏ dấu vân tay.
  • Chắc chắn rằng các giếng đang ở đúng giai đoạn trong quá trình rửa, bổ sung thuốc thử và đọc đĩa.
  • Lau phía dưới các đĩa với vải / khăn trước khi đọc.
  • Không được để khô giếng một khi đã bắt đầu thí nghiệm.

3. Nhiệt độ

  • Đưa mẫu thử về nhiệt độ phòng (22 - 28oC) khoảng 30 phút trước khi sử dụng.
  • Duy trì nhiệt độ ủ thích hợp:

          + Nhiệt độ thấp có thể làm giảm giá trị OD.

          + Nhiệt độ cao có thể làm tăng giá trị OD.

          + Bốc hơi trong giếng có thể gây ra hiệu ứng viền.

  • Nhiệt độ tối ưu cho việc ủ mẫu là 22 - 28oC.
  • Kiểm tra nhiệt độ so với nhiệt kế đã được hiệu chỉnh.
  • Ghi chú thời gian ủ và duy trì tuân thủ nghiêm ngặt thời gian.
  • Đọc đĩa theo thời gian đã quy định.

4. Giai đoạn ủ - Sự luân chuyển đĩa trong khi ủ thuốc thử

  • Trong một số hệ thống ELISA, các đĩa được luân chuyển (lắc) trong quá trình ủ để phản ứng giữa kháng thể và kháng nguyên được tốt hơn.
  • Hiệu quả của việc lắc đĩa là để hòa trộn hoàn toàn các chất phản ứng trong quá trình ủ. Bởi vì pha rắn hạn chế diện tích bề mặt của các chất phản ứng hấp thụ, do đó sự pha trộn đảm bảo rằng phân tử phản ứng sẽ được tiếp xúc với các pha rắn liên tục.
  • Trong quá trình ủ tĩnh, sự pha trộn chỉ diễn ra do sự khuếch tán của thuốc thử.
  • Như vậy, để cho phép hiệu suất các phản ứng được tối đa ứng trong điều kiện tĩnh, việc ủ sẽ được tiến hành trong thời gian lâu hơn so với trường hợp được luân chuyển.
  • Sự luân chuyển cũng cho phép ELISA được thực hiện độc lập về điều kiện nhiệt độ.
  • Sự tương tác của kháng nguyên & kháng thể phụ thuộc vào sự tiếp xúc của chúng và động năng cung cấp cho hệ thống.
  • Việc ủ tĩnh dựa trên sự khuếch tán của các phân tử và do đó phụ thuộc vào nhiệt độ.

5. Thao tác rửa

Mục đích của việc rửa là để tách các thành phần chất phản ứng/ huyết thanh gắn và không gắn. Điều này liên quan đến việc đổ bỏ các giếng và sau đó là việc bổ sung các chất lỏng vào giếng. Quá trình này được thực hiện ít nhất 3 - 6 lần cho mỗi giếng. Chất lỏng dùng để rửa giếng thường là đệm (PBS) để duy trì tính đẳng trương, vì hầu hết các phản ứng kháng nguyên – kháng thể (Ag - Ab) là tối ưu trong điều kiện đó. Nước máy không được khuyến khích sử dụng, vì nước máy khác nhau rất nhiều trong thành phần (pH, nồng độ mol, v.v.). Nói chung, các tác động cơ học với chất lỏng trong giếng là đủ để rửa các thuốc thử khỏi giếng. Một số kỹ thuật viên đổ bỏ dịch rửa sau một thời gian ngắn (thời gian ngâm) sau mỗi lần thêm (1 - 5 phút). Đôi khi chất tẩy rửa, đặc biệt là Tween- 20 (0, 05%) được thêm vào bộ đệm rửa. Điều này có thể gây ra sự tạo ra bọt quá mức dẫn đến điều kiện rửa kém, vì không khí bị mắc kẹt và ngăn ngừa dung dịch rửa tiếp xúc với bề mặt. Đối với hầu hết các trường hợp, việc bổ sung này không đóng góp đáng kể vào quá trình rửa. Khi sử dụng chất tẩy rửa, phải thực hiện sao cho không ảnh hưởng xấu đến chất phản ứng (biến tính kháng nguyên), và hơn nữa là cần ngăn ngừa bọt trong giếng.

  • Rửa bình thường : Trong đĩa rửa thủ công (bằng tay) , yếu tố quan trọng nhất là mỗi giếng đều được rửa, do đó, không để bong bóng không khí bị mắc kẹt trong giếng hoặc không được chạm ngón tay lên cạnh của giếng.
  • Strip/ Máy rửa: Lập trình chu kỳ rửa khác nhau cho từng mẫu, bảo dưỡng cẩn thận là cần thiết, vì chúng dễ bị lỗi máy, chẳng hạn như có một vòi phun đặc biệt bị chặn.

Ảnh minh họa: Plate Washer (Nguồn: http://www.mtxlsi.com/)

6. Một số lưu ý khác

a) Chuẩn bị Cơ chất

  • Chuẩn bị mới 2 cơ chất A và B (trong 2 hệ thống thuốc thử)
  • Không để dung dịch cơ chất lâu hơn 1 giờ.
  • Thực hiện theo đúng quy trình thêm cơ chất.
  • Nhiệt độ của dung dịch là quan trọng bởi vì nó ảnh hưởng đến tỷ lệ phản ứng màu.
  • Không để cơ chất mới vào bình chứa cơ chất cũ.
  • Làm sạch chai đựng dung dịch cơ chất cũ với H SO và  rửa sạch triệt để với nước cất

b) Chất liên kết (Conjugates)

  • Bảo quản theo nhiệt độ khuyến cáo.
  • Không bao giờ để lại chất liên kết đã pha loãng cho lần sử dụng sau.
  • Luôn pha loãng dung dịch liên kết ngay trước khi sử dụng.
  • Không bao giờ để chất liên kết trong thời gian quá dài.

c) Bổ sung mẫu

Các vấn đề thường xảy ra là sự thất bại trong việc đưa mẫu vào dung dịch đệm trong giếng hay làm mẫu dính lại trên thành giếng. Do đó hãy chú ý đến việc bổ sung mẫu.

d) Chất dừng phản ứng

Chất dừng phản ứng được thêm vào để tránh phản ứng enzyme tiếp tục xảy ra trong ELISA. Việc dừng phản ứng thường được thực hiện tại một thời điểm khi mối quan hệ giữa sản phẩm - enzyme đang trong giai đoạn tuyến tính.

Nồng độ mol của axit mạnh hoặc bazơ mạnh giúp dừng hoạt động của enzyme bằng cách biến tính enzyme. Một số chất dừng phản ứng là enzyme đặc biệt. Natri azit là một chất ức chế mạnh của HRPO, trong khi EDTA ức chế Alkaline phosphatase bởi phương thức ức chế ion kim loại. Việc bổ sung nhân tố dừng phản ứng có thể làm thay đổi quang phổ hấp thụ của các sản phẩm, vì vậy cần phải hiểu rõ về nhân tố dừng phản ứng cần sử dụng và phải sử dụng đúng chất.

e) Điều kiện phòng thí nghiệm

Các phòng thí nghiệm nên tránh sự bay hơi acid.

Tham khảo thêm: Những điều cơ bản về xét nghiệm ELISA

Nguồn: http://www.elisa-antibody.com/

 

Bài viết khác